分子克隆，你还有多少不知道的秘密

小编啊，这些我们都懂，哪是什么秘密呢？别急，小编只是怕你们实验做多了，有点儿忘了，给大家温故一下。下面开始敲黑板划重点。

你不知道的限制性内切酶：

1、保护碱基的选择和添加和限制性内切酶的用量

限制性内切酶是一种能够识别特定核苷酸序列序列并在识别位点的固定位置进行切割的一类酶，其切割后产物形成粘性末端或者平末端。广泛用于分子克隆载体构建等实验。但我们别小看这个酶，她的脾气还挺大的。小伙伴们有没有发现，大家有时候做实验，明明这段序列用特定的内切酶切割过夜都不能够切开？这是为什么呢？因为你「钱」没给够啊，不给钱，别人凭啥帮你办事儿啊。什么是限制性内切酶的「钱」呢？那我们不得不提到一个东西——保护碱基。我们都知道，在我们设计引物的时候，除了在引物的 5’添加限制性内切酶以外，还需要额外添加 1-3 个碱基，这就是我们所说的保护碱基。它的作用是能够使得限制性内切酶在识别了特定的核苷酸序列后能够更好的附着在序列上对序列进行切割，相当于一个起到支撑作用的骨架。每个限制性酶都有对应的保护碱基添加原则，并且保护碱基越多，对酶的稳固作用越强，酶活性越好。这就是所谓的拿「钱」办事儿，「钱」给够了，事儿自然就办好了。那我怎么知道这个保护碱基该如何添加呢？别急，小编已经将不同限制性内切酶保护碱基情况整理成表格放在文末了，各位有需要的小伙伴可以到文末查阅。

又有小伙伴问，我保护碱基也添加了，酶切时间也足够长，为什么有时候还是不能够将质粒切开呢？这里，小编悄悄告诉大家，其实有的时候也不是拿「钱」就一定能办好事儿，遇到困难的事情，「钱」是解决不了的，需要靠众人的力量。不同的质粒可能存在多种复杂的结构，像缺刻、超螺旋等。有的限制性内切酶并不能够完全应对这些复杂的结构，需要加大酶的使用量或者配合其他能够适应质粒结构的酶进行双酶切才能够确保这些酶能够完成切割。只是，对于应对结构不同的酶所需要添加的酶量，小编目前也还在进行验证，到时候一定会将常见的酶种类分享给大家。

2、限制性内切酶和质粒的甲基化

小编之前说过，限制性内切酶脾气很大，遇到「不开心的事儿」她就会罢工。同样地，当限制性内切酶遇到了甲基化的质粒，她也就这样悄无声息地罢工了，留下实验失败的你独自流泪。

甲基化是细菌用来保护自己的基因序列不被自身合成的限制性内切酶所切割，是细菌的一种自我保护机制。常见的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核细胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能够识别特定的序列，从而在特定的碱基上进行。如果当限制性内切酶所识别的序列与甲基化识别的序列相同或者重叠时，限制性内切酶将不能够切开该位点序列（见表二）。另外，还需注意一点，我们实验所采用的大肠杆菌是否是属于上述甲基化的阳性菌株，如果是，恭喜你，实验失败很正常，懵逼树下的懵逼果等你去尝尝。所以，快去看看文末你所用的限制性内切酶是否和甲基化的识别序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的阳性菌株吧。

小编帮你们列出的常见 41 种内切酶的表格中可能收到甲基化影响的限制性内切酶的种类，其中橙色标注的表示该酶的识别序列与所对应的甲基化的识别序列相同，当存在该种类甲基化的时候，限制性内切酶的功能将会被抑制；蓝色标注的表示该酶的识别序列与所对应的甲基化的识别序列有部分重叠，需要具体看酶切位点序列相邻部分是否存在特定的碱基，使得与该酶对应的甲基化序列相同，如果不同，则不受到甲基化的影响；绿色标注的表示该酶只有在真核生物中才会收到甲基化的影响。所以，大家以后遇到类似的问题，多思考思考是否存在甲基化的影响呢！

等等！你们可能发现了，小编你是不是说漏了一个。表中不是还有一个红色标注的吗？那个又是怎样一个情况呢？嗯！这都被你们发现啦。是的，这里面存在一个特殊的酶——DpnI，这个酶也是马上小编要告诉大家的另一个秘密。我们看看怎么回事吧！


不用酶切，PCR 也可以帮你完成分子克隆：

1、反式 PCR

我们都知道，在做分子克隆的时候，必须要用限制性内切酶将环状质粒切割成为线性，才能够连接我们的目的片段。那么，大家有没有想过，在我们的酶切位点两头，以质粒为模板设计引物，反向直接扩增我们的质粒呢？这样的质粒天生就是线性化的质粒，而且无需进行摇菌培养质粒提取和酶切等复杂的操作。这就是我们所说的反式 PCR。是不是很简单？对，就是这么简单到你怀疑人生。但有一个问题来了，整个反应体系中的模板即我们原来的环状质粒，如果在进行克隆连接的时候岂不是也被导入到宿主细胞中表达，也就是说我们挑菌的时候也是有概率会挑到这些空载载体的！如何解决？接着看就明白了。

2、DpnI 切割反式 PCR 中的环状质粒

之前小编在甲基化中提到过，我们还有一个特殊的限制性内切酶没有提到，它就是 DpnI。这个酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性内切酶，它只有当存在 GATC 序列被甲基化的时候才能够发挥它的活性，进行完全的切割，也就是说它和其他受到甲基化影响的酶是相反的。甲基化只有在甲基化阳性的原核或者真核生物中才能够存在。所以，当我们用 Dam+菌株提取的质粒进行反式 PCR 的时候，为了降低后期克隆实验的空载率，我们需要使用 DpnI 来消化我们原来用于模板扩增的环状质粒，由于质粒上存在多个 GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能够将原来环状质粒直接切割成多条片段，另外，PCR 扩增的线性质粒并没有在原核生物体内进行过甲基化，因此线性质粒的序列不会被 DpnI 识别切割，从而达到我们分离环状质粒和线性质粒的需求。这里需要提醒下小伙伴们，如果你们的质粒模板是从 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再适用了！至于原因，大家可以想一想，小编就不在这里赘述了。

关于限制性内切酶，目前已经商业化的品种已经两百多种，作为目前排名靠前的内切酶生产商，莫纳生物对这类基础工具酶已经研究探索多年，为了打破国外四十多年的垄断地位，绕过zhuan利保护，莫纳生物研发了全新的内切酶生产工艺，目前在售的快速内切酶已经四十多种（持续增长中），现阶段已经基本满足常规的生物学实验需求。

都 9102 年了，你还在用传统的方法做克隆？

克隆虐我千百遍，我待克隆如初恋。做个克隆，至少需要两天的时间，还要忙前忙后准备一大堆需要的东西。麻不麻烦，累不累啊！有这个时间，我多看两篇文献，多编两行 Python 代码不好吗？小编说过，越基础的实验越是需要牢固掌握，但同样越是基础的实验越是需要我们节省时间，提率。

无缝克隆在几年前可能是个陌生的词汇，但随着外各大品牌厂商的开发与成熟，你敢说你还没听过这样一个神奇的实验？莫纳生物也有研发的无缝克隆试剂盒哟，接下来小编就给大家科普一下。

1、什么是无缝克隆，它的原理是什么？

无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 5-15 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。但需要注意的是，我们在无缝克隆前进行 PCR 扩增的时候，载体与片段之间、片段与片段之间需有 15-20 碱基的一段同源序列，这是为什么呢？因为我们无缝克隆的试剂盒里面存在三种酶，分别是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能够将序列从 5’-3’开始降解，此时暴露出载体以及片段的3’同源序列，经过碱基互补配对，DNA 聚合酶添加缺失碱基后由 DNA 连接酶将片段与载体进行连接，从而达到载体重组的功能。因此，如果不添加同源序列，载体与片段、片段与片段之间将无法进行连接。
 
2、无缝克隆引物设计

大家现在对无缝克隆已经有一个深入的了解了，那么我们来看看，在做无缝克隆之前，跑 PCR 的时候引物设计有哪些要求呢？

引物添加的顺序 5’-3’：
同源序列+特异性引物（克隆后无需进行酶切，适用于表达载体）
同源序列+保护碱基+酶切位点+特异性引物（克隆后还需要进行酶切或者亚克隆）

这里需要提醒大家注意一下，由于无缝克隆的引物在普通 PCR 的引物基础上添加了额外的附加碱基（同源序列、保护碱基、酶切位点），Tm 值可能会较常规引物的高。但我们在做 PCR 的时候，一、二次循环，几乎只有特异性引物的序列与模板结合，此时应该只计算特异性引物的 Tm 值，否则会出现退火温度过高，PCR 扩增不出条带。但后面的循环，特异性引物和附加碱基均能够和一、二次扩增产物为模板进行结合扩增，并占据  。此时引物 Tm 值应该按照整条引物的 Tm 值计算。因此，在做无缝克隆前的 PCR 扩增时，建议大家在第二个循环后提高退火温度进行 PCR 扩增，更有利于产物的形成。

3、无缝克隆的连接时间的选择

虽然说，无缝克隆带给我们很多的便利，但小编需要告诉大家需要注意一点儿的是，无缝克隆连接的片段数量有限，一次连接超过 6 个或者载体+片段超过 13 Kb 后，其连接时间会增加且阳性率会降低，甚至出现实验失败的情况。因此，在做无缝克隆实验的时候需要多多计算一下。

结束语：

看了这么多，是不是发现，原来一个小小的分子克隆实验还有这么多的学问？还有好多自己不知道的秘密。其实，大家做实验的时候，不要仅仅停留在它的一个表面，认为它只是一个再基础不过的东西，深入探索一下会发现里面其实还有很多有趣的事情和讲究，这里面只是告诉了大家一些比较实用的方法和技巧，更深层次的东西大家下来可以慢慢摸索。祝大家实验顺利！