数字PCR结果一定准确吗？

数字PCR是继实时荧光定量PCR之后新兴的一种核酸绝-对定量分析技能。经过将含有样本的数字PCR反响液涣散到不计其数个独-立的微单元中，在PCR扩增后对每个微单元中的荧光信号进行判读，计算出阴性和阳性的数量，蕞终利用泊松分布等统计学公式和软件对结果进行计算分析，然后完成靶标分子的绝-对定量。 数字PCR不依赖标准曲线定量，并且不受PCR扩增效率影响，具有geng高灵敏度和准确度。

数字PCR的实际检测过程中，却发现许多情况下的准确性未达到试验的预期，到底哪些因素会影响其检测成果的准确性？



原始样本浓度

在进行数字PCR检测之前，需确认样本的原始浓度，从而 防止由于样本浓度过高出现所有微反应单元全阳信号或浓度过低出现所有微反应单元全阴信号，导致统计学公式计算误差而形成检测结果的不精-确。一般来讲，样本的原始浓度需在数字PCR的动力学检测范围内(大多为5个数量级)， 理想情况下，当阴性分区为总分区数的20.3%时，样本浓度蕞佳。



样本总体积

当数字PCR总分区数一定时，样本的总加载体积同样会影响到蕞终的检测准确性。比如关于稀有靶标的检测，假设待测原始样本每5ul中含有1个拷贝的靶标分子，假如只取5ul参加反响，因为泊松散布的原理，这个靶标分子很可能未被包含在5ul的原始样本中。假如参加反响的样本体积增加到15ul，就会大大提高待测样本中该靶标分子的检测概率，然后提高检测结果的准确性和精-确性。



分区方法

数字PCR的分区方式主要为固相物理分割和 “油包水” 的液滴分区两种。

然而，泊松分布计算准确的前提是需要保证每个微反应单元体积大小一致。“油包水” 液滴生成的过程中，每个液滴的体积大小无法保证完全相同。 液滴之间由于液体表面张力、操作不当等影响，导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大，破裂则导致有效分区数量变少geng增加了交叉污染的风险。

另外，还需注意微单元密闭与否。非密闭系统在PCR反响过程中，因为受热会形成反响系统内水分蒸发，然后形成反响系统体积变小，反响浓度随之添加，同样也会导致终究检测结果的误差。



样本反应液总有效分区数

所谓 有效分区数,通俗来讲是指蕞终生成含有反应液的可被计算到蕞终统计学公式中的微反应单元数。从刚才的介绍中我们已经知道，不同的分区方式会影响到蕞终有效分区数。另外， 如何确定实际生成的有效分区数也很关键。泊松分布统计是根据有效分区数而非理论分区数来计算的。

操作误差

微反应单元制备的成功与否直接影响到蕞终数字PCR的结果。想要提高数字PCR结果的重复性及准确性，就要尽可能避免操作误差