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关于免疫荧光染色和注意事项介绍

发布时间:2022-06-02 阅读:96

  免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
  
  免疫荧光染色
  
  (1)冰冻切片用0.01moULPBST(或PBS)漂洗或冲洗3次,每次5min。
  
  (2)3%H2O2孵育10min,再用0.01mol/LPBS冲洗3次,每次5min。
  
  (3)5%一8%的正常动物血清(山羊或马血清)孵育30-60min。
  
  (4)洗掉血清,滴加一抗(0.01mol/LPBS配制),4℃过夜。
  
  (5)吸出一抗,0.01mol/LPBS冲洗3次,每次5min,加入荧光标记的二抗(0.01mol/LPBS配制),4℃过夜。
  
  (6)吸出二抗,0.01mol/LPBS冲洗3次,每次10min。
  
  (7)封片剂封片,荧光显微镜观察照相。典型的实验结果见图20.2B。
  
  注意事项:
  
  (1)由于荧光容易淬灭,一般仅能维持几个小时,因此,荧光二抗应避光保存,即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相,目前有市售的荧光增强剂,可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。
  
  (2)常用的荧光素有以下几种,绿色荧光:FITC、AlexaFluor488和GFP;红色荧光:TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed;蓝色荧光:Hoechst、DAPI;黄色荧光:YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
  
  (3)不同的荧光素激发的波长不同,因此,选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm,蓝光的激发波长为435-490nm,绿光的激发波长为546nm左右。
  
  (4)荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。
  
  (5)免疫荧光的组织要求很高,载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时,需注意染液的pH、浓度和染色温度,还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光,如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光,维生素A呈绿色自发性荧光等。

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