细胞冻存、复苏及细胞均匀铺板技巧详解

  细胞冻存、复苏及细胞均匀铺板技巧详解

  细胞冻存：

  1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞，在冻存前一天换液

  2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。

  3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。

  4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。

  5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀

  6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

  7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

  细胞复苏

  室内紫外消毒;培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。

  自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。

  去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。

  于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养

  记录复苏日期;次日换液。

  细胞均匀铺板技巧：

  1、一般96孔板,每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度，太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转(逆时针效果不好)，依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。

  6孔板12孔板或24孔板，均采用将个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。

  2、细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。

  3、如果实验室有平板振荡器的话，建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。

  4、细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮!还有转移到六孔板后，是要晃得!晃的时候不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀!

  5、一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。

  6、计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。

  7、放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5到6次，但关键的是摇完后直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

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