那些年我们一起追过的转录组问题~
zui近小编的朋友圈已被各种秀恩爱的刷屏了，宝宝很是苦恼，在这个既温馨又伤感的节日里，想想自己曾经追过的女生，想想自己曾经。。。，算了，还是想想曾经困扰过自己的转录问题吧~RNA-seq已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域，今天小编就为大家整理了一波RNA-seq常见问题解答，给这个开学季的朋友圈来一点不一样的.
样本制备注意事项有哪些？
1.细胞类样本送样注意事项
细胞系样本培养过程中常会出现支原体污染，将直接影响细胞生长状态。对于去rRNA链特异性文库，因去rRNA试剂盒具有物种、组织部位特异性，针对真核生物的去rRNA试剂盒无法去除支原体rRNA，会严重影响数据质量以及有效数据比例，对分析结果的准确度产生干扰。
建议细胞类样本在测序前，先使用一步法支原体检测试剂盒或qPCR技术进行支原体检测，从源头有效避免支原体污染。
2.对于植物、动物、酵母等来源的RNA，一般推荐用哪种方法进行提取
RNA提取质量的好坏主要取决于样品本身的新鲜程度和多糖多酚、次生代谢物的含量；针对大多数的动植物组织样品，Trizol试剂都能获得较好的提取效果；对于多糖含量特别丰富的植物组织，如棉花根、桦树根、兰花等，可采用天根多糖多酚试剂盒提取；对于脂肪组织，可采用QIAGEN的RNeasy lipidmini kit 进行提取。
样本检测时需要达到什么要求才认为样品合格
样本检测主要关注的指标为总量、RIN值、OD260/280以及28S/18S（原核生物为23S/16S）。其中RIN值及28S/18S是评估RNA完整性的主要指标，RIN值越高，28S/18S越接近2表明完整性越好。一般RIN值大于6.5可尝试建库，RIN值过低会影响分析结果的准确度。但对于一些特殊样品，比如某些昆虫和水产动物，没有28S条带，就不能参考RIN值，一般只要18S前基线平稳可认为样品合格。
生物学重复应该如何来设定
1.区分生物学重复与技术重复
生物学重复：指样本重复，不同生物样本做同样实验；
技术重复：一般是对一个生物样本的实验指标测定多次。
如下图：对照组A、B、C三只小鼠（co
2.生物学重复设置几个合适
一般推荐生物学重复≥3，动物或人的个体差异比较大，建议至少做5-10个重复。
3.生物学重复取样要求
植物取样：所取试验田，长势，外部形态特征相同；
动物取样：遗传背景，饲养条件，年龄，性别，外部形态特征相同；
混合取样：保证混合样品处理方式，处于发育阶段，个体外部形态特征相同。
建库方法如何选择？
1.什么是链特异性文库
链特异性建库可以保留测序时转录本的方向信息，即可以确定转录本是来源于基因组上面的正义链还是反义链，此外，还能确定基因结构，定量转录本，鉴定non-coding转录本等。
2.普通转录组与lncRNA建库方法区别
普通转录组基于真核生物mRNA含有polyA尾的特性，先用oligodT磁珠富集纯化，然后构建普通转录组文库。
因只有部分lncRNA含有polyA尾，为获得更多的lncRNA有效信息，选用去rRNA试剂盒进行富集，然后通过构建链特异性文库以有效区分不同lncRNA类型及准确定位，保留RNA的方向性信息，以便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息。
3.lncRNA测序前注意事项
1）必须有转录组，且参考基因组组装水平及注释信息完善，至少为scaffold水平。
2）需要有适用的去rRNA试剂盒。
目前主要应用的去rRNA试剂盒为Ribo-Zero以及KAPA试剂盒。对于非常规物种进行lncRNA测序时，需确定有无适用的去rRNA试剂盒，否则rRNA去除效果不佳会严重影响数据质量。
篇幅有限，今天就告一段落，本期总结了RNA-seq样本准备和建库问题，欢迎热情点赞留言，小编会继续整理分享，搓手抖腿期待中~~~我们下期不见不散~~~
