土壤样品含有大量的微生物,其中大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取 DNA 是研究土壤微生物zui为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物 DNA 的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中,经过有效的破壁方法使微生物的DNA 全部释放到裂解液中,然后再进行分离提取,如 Zhou 的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中,如 Buffer PBS 等,把微生物从土壤中分离出来,然后再进行 DNA 的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金属盐对 DNA 提取带来的影响,但是这种方法会丢失许多微生物,得到的 DNA 并非土壤样品中的全基因组 ( 宏基因组 ) ,目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取 DNA 可zui大可能性地获得全基因组,但是这种方法却面临以下几个问题:
1. 腐殖酸的污染。土壤中,特别是森林,草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常类似,在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用,如 PCR ,酶切的失败。
2. 裂解方法。土壤样品中含有各种微生物,如细菌和真菌等。革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁,让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组 DNA 的关键。由于土壤样品的复杂性,使用酶法 ( 如溶菌酶,破壁酶,蜗牛酶 ) 或液氮研磨都不可行,因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。
3. DNA 得率难于控制。土壤样品或因肥沃,或因贫瘠,或因含水量丰富,或因干枯,或因取样的深浅度,都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品 DNA 含量往往会差别成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化学成分,如重金属盐,粘土物质都会造成DNA 得率降低。
Omega Biotek 公司的 E.Z.N.A. Soil DNA Kit 是目前土壤 DNA 提取zui为优化的试剂盒。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法,可不需特殊的珠磨仪,在点动涡旋仪就可进行,适合于广大的研究室。试剂盒中 HTR Reagent 是 Omega Biotek 公司开发的腐殖酸吸附剂,能去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式,可去除土壤中各种可溶性金属盐,以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤 ( 部分是客户反馈 ) :自然保护区森林的土壤 ( 长达 30-40 年森林土壤,表层有 30 -50cm 落叶层 ) ,红树林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,矿石区泥土,有机物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空调管道堆积物等。
实验方法
为表明该试剂盒的性,我们选择以下不同组织样品进行 DNA 提取实验,每个样品重复 3 次。
l 森林类样品:自然保护区森林土壤 ( 广东黑石顶自然保护区 ) 和海南岛红树林保护区
l 矿石区样品:矿石区水底土壤 ( 湿 ) 和矿石区地表土壤 ( 干 )
l 耕地样品:稻田土壤,菜地土壤
l 有机物污染地表样品:污水沟衍泥和生活垃圾堆放区
操作方法(按 Soil DNA Kit 试剂盒进行)简单描述以下:
1. 取▲ 0.5 g 森林土壤 / 耕地土壤 ,或 ◆ 4g 矿石区土壤和有机物污染土壤至 15ml 离心管中;
2. 加入▲ 0.5g 酸洗玻璃珠,或 ◆ 4g 酸洗玻璃珠;
3. 加入▲ 1ml Buffer SXL MLus ,或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus ;
4. 立即在涡旋仪上zui高速涡旋 3 分钟。
5. 加入▲ 100ul ,或◆ 800ul Buf fer DS ,涡旋 15s 混匀
6. 转移至预热至 70 oC 水浴锅中,水浴 10-15 分钟。
7. 3000 x g 离心 3 分钟,转移▲ 800ul ,或◆ 7 ml 上清,并加入▲ 270ul Buffer SP2 或◆ 2.3 ml Buffer SP2 ,涡旋混匀;
8. ▲ 10,000 x g 离心 5 分钟,或 ◆ 5 , 000 x g 离心 10 分钟;
9. 把上清液转称至新的 2ml/15ml 离心管中,加入 0.7 倍的异丙醇。 ( 在处理矿石区样品时和有机物污染的样品中,还加入 133ul 糖原溶液 ),涡旋混匀;
10. ▲ 10,000 x g 离心 5 分钟,或 ◆ 5 , 000 x g 离心 10 分钟沉淀收集 DNA 。
11. 倒弃上清液,并反扣于吸水纸上 5 分钟;
12. 加入 200 ul Elution Buffer ,涡旋 5 秒。 6 5 ℃ 水浴 20-60 分钟,让 DNA 充分溶液。
13. 加入 50ul HTR, 反应 2min 后,离心,取上清。
14. 上清加入等体积(约 200ul ) XP2 Buffer ,均匀后上柱。
15. 加入 300ul XP2 Buffer ,洗涤一次。
16. 加入 700ul SPW Wash Buffer ,洗涤两次。
17. 空甩后,加入适当量的 Elution Buffer 洗脱即可。
实验结果
1. DNA 电泳结果
取 10 ul 纯化的基因组 DNA 上样于 0.8% 琼脂糖凝胶, 80V 电泳 30 分钟,结果如下。
0.5g 森林类土壤样品
( 前两个自然保护区森林土壤,后两个为红树林土壤 )
0.5g 耕地类土壤样品
A: 水稻田土壤
B: 玉米土壤
4g 有机物污染土壤样品
A: 生活垃圾堆放地
B: 污水沟底泥
4g 矿石泥
1 和 3 是两个矿石区水底土壤 ( 湿 )
2 和 4 矿石区地表土壤 ( 干 )
2. DNA 纯度和产量分析
土壤类型
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A260
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A280
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A230
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A320
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A260/A280
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产量 ug
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6
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0.1792
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0.1041<
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