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关于土壤基因组DNA提取你了解多少吗?

发布时间:2018-10-19 阅读:1462

   土壤样品含有大量的微生物,其中大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取 DNA 是研究土壤微生物zui为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物 DNA 的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中,经过有效的破壁方法使微生物的DNA 全部释放到裂解液中,然后再进行分离提取,如 Zhou 的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中,如 Buffer PBS 等,把微生物从土壤中分离出来,然后再进行 DNA 的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金属盐对 DNA 提取带来的影响,但是这种方法会丢失许多微生物,得到的 DNA 并非土壤样品中的全基因组 ( 宏基因组 ) ,目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取 DNA 可zui大可能性地获得全基因组,但是这种方法却面临以下几个问题:  

1.          腐殖酸的污染。土壤中,特别是森林,草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常类似,在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用,如 PCR ,酶切的失败。  

2.          裂解方法。土壤样品中含有各种微生物,如细菌和真菌等。革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁,让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组 DNA 的关键。由于土壤样品的复杂性,使用酶法 ( 如溶菌酶,破壁酶,蜗牛酶 ) 或液氮研磨都不可行,因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。  

3.          DNA 得率难于控制。土壤样品或因肥沃,或因贫瘠,或因含水量丰富,或因干枯,或因取样的深浅度,都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品 DNA 含量往往会差别成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化学成分,如重金属盐,粘土物质都会造成DNA 得率降低。  

Omega Biotek 公司的 E.Z.N.A. Soil DNA Kit 是目前土壤 DNA 提取zui为优化的试剂盒。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法,可不需特殊的珠磨仪,在点动涡旋仪就可进行,适合于广大的研究室。试剂盒中 HTR Reagent  Omega Biotek 公司开发的腐殖酸吸附剂,能去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式,可去除土壤中各种可溶性金属盐,以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤 ( 部分是客户反馈 ) :自然保护区森林的土壤 ( 长达 30-40 年森林土壤,表层有 30 -50cm 落叶层 ) ,红树林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,矿石区泥土,有机物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空调管道堆积物等。  

 

实验方法  

为表明该试剂盒的性,我们选择以下不同组织样品进行 DNA 提取实验,每个样品重复 3 次。  

l           森林类样品:自然保护区森林土壤 ( 广东黑石顶自然保护区 ) 和海南岛红树林保护区  

l           矿石区样品:矿石区水底土壤 ( 湿 ) 和矿石区地表土壤 (  )  

l           耕地样品:稻田土壤,菜地土壤  

l           有机物污染地表样品:污水沟衍泥和生活垃圾堆放区  

 

操作方法(按 Soil DNA Kit 试剂盒进行)简单描述以下:  

1.          取▲ 0.5 g 森林土壤 / 耕地土壤 ,或  4g 矿石区土壤和有机物污染土壤至 15ml 离心管中;  

2.          加入▲ 0.5g 酸洗玻璃珠,或  4g 酸洗玻璃珠;  

3.          加入▲ 1ml Buffer SXL MLus ,或  8 ml Buffer SXL MLus   

4.          立即在涡旋仪上zui高速涡旋 3 分钟。  

5.          加入▲ 100ul   ,或◆ 800ul Buf fer DS ,涡旋 15s 混匀  

6.          转移至预热至 70 oC 水浴锅中,水浴 10-15 分钟。  

7.          3000 x g 离心 3 分钟,转移▲ 800ul ,或◆ 7 ml 上清,并加入▲ 270ul Buffer SP2 或◆ 2.3 ml Buffer SP2 ,涡旋混匀;  

8.           10,000 x g 离心 5 分钟,或  5  000 x g 离心 10 分钟;  

9.          把上清液转称至新的 2ml/15ml 离心管中,加入 0.7 倍的异丙醇。 ( 在处理矿石区样品时和有机物污染的样品中,还加入 133ul 糖原溶液 ),涡旋混匀;  

10.        10,000 x g 离心 5 分钟,或  5  000 x g 离心 10 分钟沉淀收集 DNA   

11.       倒弃上清液,并反扣于吸水纸上 5 分钟;  

12.       加入 200 ul Elution Buffer ,涡旋 5 秒。 6 5  水浴 20-60 分钟,让 DNA 充分溶液。  

13.       加入 50ul HTR, 反应 2min 后,离心,取上清。  

14.       上清加入等体积(约 200ul  XP2 Buffer ,均匀后上柱。  

15.       加入 300ul XP2 Buffer ,洗涤一次。  

16.       加入 700ul SPW Wash Buffer ,洗涤两次。  

17.       空甩后,加入适当量的 Elution Buffer 洗脱即可。  

 

实验结果  

1.        DNA 电泳结果  

 10 ul 纯化的基因组 DNA 上样于 0.8% 琼脂糖凝胶, 80V 电泳 30 分钟,结果如下。  

 

0.5g 森林类土壤样品  

( 前两个自然保护区森林土壤,后两个为红树林土壤 )  

 

0.5g 耕地类土壤样品  

A: 水稻田土壤  

B: 玉米土壤  

   

4g 有机物污染土壤样品  

A: 生活垃圾堆放地  

B: 污水沟底泥  

 

4g 矿石泥  

1  3 是两个矿石区水底土壤 ( 湿 )  

2  4 矿石区地表土壤 (  )  

 

2.        DNA 纯度和产量分析  

土壤类型  

A260  

A280  

A230  

A320  

A260/A280  

产量 ug  

6  

0.1792  

0.1041<

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