多重PCR扩增试剂盒，你使用对了吗？

试剂盒的正确使用与否直接关乎着试验的成功与否，快来对照一下多重PCR扩增试剂盒，你使用对了吗!

所谓多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR），也称复合PCR，由Chambehian' 在1988年提出（Chambehian' et.al.Nucleic Acids Res、1988 Dec 9; 16(23): 11141–11156.），基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR的反应体系是加入多对引物，各对引物分别结合在模板的相应位置，zui终扩增出多条DNA片段。

多重PCR实验流程

相比于液相杂交，多重PCR的是特异性强，实验周期短，技术也相对简单。下面为大家介绍实验流程：

我们公司多重PCR的实验，就是由两轮PCR完成。di一轮PCR的作用是利用目标区域特异的引物去扩增，得到的产物是目标区域的富集片段，因此，此步骤也是实现了从基因组中“捕获”目标区域的目的。

之后把得到的产物进行纯化，再通过第二轮PCR中引入Index和Adaptor。

这样，在经过了两轮PCR后，就获得了完整的文库。把第二轮PCR产物纯化后，就可以定量，测序了。

实验注意事项：

1、先从样本说起，我们公司的多重PCR平台可以做的样本包括血液，唾液，口腔拭子，在实验中，对于DNA投入量要求不是很高，根据不同项目需求，DNA投入量的范围在100 pg到100 ng 之间。

2、进行PCR反应前，可以将所有 gDNA 的浓度稀释到同一浓度，并转移到 PCR 8 联管中，一方面是便于排枪操作，另一方面是加入相同起始量的 gDNA，这样可以降低zui终文库的浓度差异，便于混合文库。

3、大多数情况下引物是1管，操作相当方便；当目标区域是外显子或者是其他连续区域时，我们会把引物分装为2管，分别命名Primer pool T1与Primer pool T2，这时需要第二轮PCR前把产物合并，再进行下一步反应。

4、执行多重PCR反应时，特别是样本量多的情况下，可以将 T1 设为一组，T2 设为一组，便于制备反应试剂混合液和排枪操作； 并把解冻好的试剂放置在冰盒上，在冰盒上进行加样操作。

5、在实验中，可以在PCR管壁上和管盖上同时进行反应编号标记，防止高温或其他原因导致记号消失，避免后续产物混合操作失误， 造成样本交叉污染。

6、第二轮PCR后，因为YF Buffer B试剂比较粘稠，在清洗纯化的时候不能吸走所有试剂，可以剩余5-10μl，否则会把磁珠一起吸走，造成样品的损失，导致产物回收率下降。

当实验完成后，正常文库浓度处于5-30 ng/μl，而片段长度一般在280-460 bp之间，且主峰前后无杂峰，就可以进行测序了。

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