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多重PCR扩增试剂盒,你使用对了吗?

发布时间:2019-09-04 阅读:150

试剂盒的正确使用与否直接关乎着试验的成功与否,快来对照一下多重PCR扩增试剂盒,你使用对了吗!

 

所谓多重PCRMultiplex Polymerase Chain ReactionmPCR),也称复合PCR,由Chambehian' 1988年提出(Chambehian' et.al.Nucleic Acids Res1988 Dec 9; 16(23): 1114111156.),基本原理与常规PCR相同,区别在于多重PCR的反应体系是加入多对引物,各对引物分别结合在模板的相应位置,zui终扩增出多条DNA片段。

 

多重PCR实验流程

相比于液相杂交,多重PCR的优势是特异性强,实验周期短,技术也相对简单。下面为大家介绍实验流程:

我们公司多重PCR的实验,就是由两轮PCR完成。di一轮PCR的作用是利用目标区域特异的引物去扩增,得到的产物是目标区域的富集片段,因此,此步骤也是实现了从基因组中“捕获”目标区域的目的。

之后把得到的产物进行纯化,再通过第二轮PCR中引入IndexAdaptor

这样,在经过了两轮PCR后,就获得了完整的文库。把第二轮PCR产物纯化后,就可以定量,测序了。

 

实验注意事项:

1、首先从样本说起,我们公司的多重PCR平台可以做的样本包括血液,唾液,口腔拭子,在实验中,对于DNA投入量要求不是很高,根据不同项目需求,DNA投入量的范围在100 pg100 ng 之间。

2、进行PCR反应前,可以将所有 gDNA 的浓度稀释到同一浓度,并转移到 PCR 8 联管中,一方面是便于排枪操作,另一方面是加入相同起始量的 gDNA,这样可以降低zui终文库的浓度差异,便于混合文库。

3、大多数情况下引物是1管,操作相当方便;当目标区域是外显子或者是其他连续区域时,我们会把引物分装为2管,分别命名Primer pool T1Primer pool T2,这时需要第二轮PCR前把产物合并,再进行下一步反应。

4、执行多重PCR反应时,特别是样本量多的情况下,可以将 T1 设为一组,T2 设为一组,便于制备反应试剂混合液和排枪操作; 并把解冻好的试剂放置在冰盒上,在冰盒上进行加样操作。

5、在实验中,可以在PCR管壁上和管盖上同时进行反应编号标记,防止高温或其他原因导致记号消失,避免后续产物混合操作失误, 造成样本交叉污染。

6、第二轮PCR后,因为YF Buffer B试剂比较粘稠,在清洗纯化的时候不能吸走所有试剂,可以剩余5-10μl,否则会把磁珠一起吸走,造成样品的损失,导致产物回收率下降。

 

当实验完成后,正常文库浓度处于5-30 ng/μl,而片段长度一般在280-460 bp之间,且主峰前后无杂峰,就可以进行测序了。

 






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