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古朵生物解析:细胞分离的常见问题解答

发布时间:2019-09-23 阅读:107

     原代细胞(Primary cells):是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。这里的组织主要指:组织器官、外周血及胚胎等。

    原代细胞培养:由于原代细胞生长缓慢,繁殖一定的代数停止生长(一般10代以内)。所以一般认为:培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。



细胞分离的常见问题解答:

Q:为什么我取得原代肿瘤组织,分离的却不是肿瘤细胞?

A:取材时,我们要熟悉所需组织的类型和部位特征,选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。

Q:若是细胞中混成纤维细胞,如何去除?

A:成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快,可利用反复贴壁法使二者分离,进而达到清除成纤维细胞的目的。

Q:为什么离心后,没有细胞分离出来?

A:需要考虑消化酶的因素,由于肿瘤组织较致密,胰酶无法消化,一般选用胶原酶,如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法,如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别:

 

胶原酶

胰酶

来源

细菌

胰脏

消化组织

纤维多的硬组织

软组织

对细胞影响

伤害小

长时间有损伤

作用力度

缓和

注:胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。

Q:消化时间如何确定?

A:具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。

Q:消化之前为什么用EDTA?

A:EDTA是一种非酶消化物,又称螯合剂,对一些组织,尤其是上皮组织分散效guo好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后,形成的机械力可使细胞分散。

Q:细胞量太少,长不起来怎么办?

A:有几种办法,如对没消化完的组织块反复消化,尽量多收集一些细胞;并且尽量传代到小皿里,如6孔板都可以。若是细胞仍太少,应耐心等待,尽量不要传代,只换液。

Q:细胞难以贴壁?

A:尽快使接种的细胞贴壁,是决定培养能否成功的关键。为了尽快促进细胞贴壁,可以提前1h将千分之的明胶铺于培养板。

Q:肿瘤原代细胞培养方法与细胞系不同之处在哪里?

A:培养基一般选用RPM1640,DMEM等,建议Z好能加入促生长的物质:如胰岛素、氢化可的松、雌激素、EGF等因子。


Q:皮肤组织作为正常组织,与肿瘤组织分离主要区别在哪里?

A:首先,皮肤组织需要用中性分离酶dispaseII将表皮分离出来;其次,在消化时,用的是胰酶,而非胶原酶,并且胰酶的浓度用的是0.05%,而不是0.25%。

Q:表皮的分离需要注意什么?

A:表皮一般可以完整的撕脱下来,温度的变化,孵育的时间以及所用的酶的浓度都会影响表皮是否能完整剥离。

Q:为什么需要无Ca血清来终止消化?

A:因为Ca2+的浓度可以影响角质形成细胞的生长,并且培养时必须严格调控培养基中的Ca2+浓度。


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