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两种不同的总蛋白提取方法总结

发布时间:2019-10-14 阅读:97

   蛋白质提取与制备蛋白质种类很多,性质上的差异很大,既或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大,且又处于不同的体系中,因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。本文分别介绍了从新鲜样品中提取总蛋白和从Trizol裂解液中分离总蛋白的方法和步骤。希望与各位老师和同学交流。

  膜蛋白具有多种功能,在细胞识别、细胞信号转导、运输等有着中着重要的角色,因此也是极佳的药物靶点。抽提膜蛋白主要是进行蛋白组分析:常用的实验是非变性胶电泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot等。本文叙述了总蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。

  一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)

  1、自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

  2、将40ml 菌液在12000g,4℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

  3、超声粉碎,采用300w,10s超声/10s间隔,超声20min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

  4、1000g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。

  缺点:Western Blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

  二、从Trizol裂解液中分离总蛋白

  1、Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯fang分层,2-8℃下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。

  2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3min,2-8℃不超过2000g离心5min。

  3、将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇,室温放置10min,2-8℃下12000g离心10min,弃上清。

  4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液,室温放置20min, 2-8℃下7500g离心5min,弃上清,重复洗涤2次。Z后加入2ml无水乙醇,涡旋后室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清。

  5、冷冻干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50℃温浴使其完全溶解,2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。

  6、替代方案:将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g离心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白实验。

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