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从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则和注意事项

发布时间:2019-10-17 阅读:73

在分子生物学实验中,我们通常需要分离纯化特定分子量的DNA片段,用于接下来的实验,比如酶切、连接的工作。下面主要介绍从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则和注意事项,其主要原则有两项:

1、去除DNA样品中的杂质:

琼脂糖是从琼脂中提取出来的,其中含有较多的酸根和羟基多糖。目前大多数级别的琼脂糖中含有硫酸酯多糖,这种物质能抑制基因克隆中使用的多种工具酶的活性,如DNA限制性内切酶、连接酶等,在回收DNA时应尽量减少这些物质的污染。不管用哪种方法进行回收DNA,都会用到2.5 mol/L醋酸铵和乙醇沉淀,再用70%乙醇漂洗数次,这样处理,可以有效地去除一些有害的有机分子和无机盐沉淀。近年来琼脂糖的质量大为提高,出现了如低熔点琼脂糖这样的产品,不但熔点降低,其中含有的对DNA工具酶有抑制作用的物质也很少,所以有些低熔点的琼脂糖可以直接在其溶液中对DNA进行内切酶消化和DNA片段之间的连接反应。

2、提高DNA片段的回收率:

DNA的回收率与DNA片段的大小有一定关系,分子量越大,回收率明显下降,大于20kb时,回收率低于20%。这是由于大的DNA片段和DEAE纤维素纸的结合力强,很难洗脱下来。DNA片段的含量也和回收率有较为密切的关系,量越少回收率越低。

回收DNA片段时应注意以下事项:

1、提高DNA上样量;

2、减小DNA回收时的洗脱容积,若容积过大,可先用正丁醇进行浓缩;

3、正确选择回收DNA片段的方法,根据回收片段的大小选择适当的回收方法。

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