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为什么用无水乙醇沉淀试剂的DNA?

发布时间:2020-03-09 阅读:73

★ 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的zui终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵,zui后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。

★ 在用乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAc或NaCl至zui终浓度达0.1~0.25mol/L?

在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合。

这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。

★ 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度geng小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀geng加完全。也可用饱和酚、氯fang抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。

★ 为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?

在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀。

在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTAgeng能稳定DNA的活性。

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