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RNA抑制剂重要吗(抑制剂,反转录)

发布时间:2020-05-15 阅读:44

    在所有RNA实验中,关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。




一、 防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或geng长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用lv仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被lv仿腐蚀,故不能使用)。

3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍:目前被认为是有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。

5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑回复在操作严格,RNA量较多时,不用也可以的。RNA量少或者是微量时,使用抑制剂就很必要

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