ELISA实验显性淡、灵敏度低是为什么？怎么解决？
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问题 |
序号 |
可能原因 |
解决方法 |
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显色淡，灵敏度偏低 |
1 |
试剂盒未充分平衡 |
试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃） |
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2 |
样品不适合做ELISA检测 |
样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分） |
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3 |
酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 |
防止板过于干燥 |
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4 |
包被抗体遭到破坏 |
操作温和，移液枪不能碰到孔底 |
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5 |
样本和抗体孵育条件不合适 |
按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。 |
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6 |
洗涤浸泡时间过长 |
按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间； |
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7 |
偶联HRP试剂污染 |
弃去试剂，重新配置 |
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8 |
错误的稀释偶联HRP试剂 |
弃去试剂，重新配置 |
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9 |
TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间 |
确定合适的孵育时间：人为判定-zui高浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65 |
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10 |
样本浓度过高或存在基质效应 |
建议做不同稀释倍数，确认样本zui佳稀释倍数。 |
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11 |
酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对 |
确认仪器设置及选择正确的波长检测。 |
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12 |
酶标板不适合做ELISA |
不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。 |
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背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2） |
1 |
洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 |
洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。 |
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2 |
底物污染，未避光保存，出现颜色 |
弃去底物，重新配置 |
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3 |
样品稀释液污染 |
弃去稀释液，重新配置 |
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4 |
吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底 |
吸头尽可能一次性使用 |
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5 |
不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间） |
zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。完全按照说明书要求。 |
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6 |
偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高 |
按照说明书调整到zui佳的浓度 |
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7 |
ELISA板子不正确的贮存 |
酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板 |
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8 |
没有正确封闭 |
在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间 |
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9 |
样本溶血严重 |
建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。 |
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重复性不佳，高CV值 |
1 |
样品不均一 |
加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致； |
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2 |
包被板表面遭到破坏 |
洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面 |
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3 |
孔与孔之间的交叉污染 |
孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用 |
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4 |
加样量不一致 |
样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 |
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5 |
边缘效应（外周孔显色较中心孔深） |
孵育时尽量100 rpm旋转混匀 |
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6 |
微量加样不准确 |
保证微量加样的准确性和均一性 |
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7 |
不正确的洗涤 |
洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤 |
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出现白板，阳性对照不显色 |
1 |
显色液变质 |
geng换新的显色液 |
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2 |
洗涤液配制有误 |
请按说明书所示稀释倍数配制 |
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3 |
未加酶结合物而认为已加入 |
注意不要漏加 |
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4 |
终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 |
每次加液前均应看清标签 |
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5 |
标准品稀释方法错误/或标准品有问题 |
请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数 |
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6 |
不同试剂盒或不同批号的试剂混用 |
建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 |
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不正常的标准曲线 |
1 |
错误的方法重悬标准品 |
加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分 |
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2 |
标准品稀释错误 |
按照说明书要求稀释标准品 |
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3 |
标准品污染 |
使用一次性的灭菌吸头， 标准品贮存于2-8 ℃ |
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4 |
错误的倍比稀释步骤 |
按照说明书倍比稀释标准品 |
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5 |
波长选择错误 |
TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 前者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。 |
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6 |
标准品混用 |
不同批号试剂勿混用 |
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7 |
试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活 |
尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温 |
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8 |
ELISA未终止而直接检测450nm和620nm |
TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律） |
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样品或标准品OD超出正常范围 |
1 |
错误的样品或标准品的稀释 |
完全按照说明书稀释 |
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2 |
偶联抗体浓度过高 |
按照说明书调整到zui佳的浓度 |
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3 |
TMB底物孵育时间过长 |
调整到合适的孵育时间 |
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4 |
样品或标准品污染 |
避免污染 |
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5 |
错误的孵育时间或温度 |
完全按照说明书 |
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6 |
孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 |
贴封片或加盖 |
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标曲很好，但是样本无法计算到数值 |
1 |
标曲选择不合适 |
选择zui合适的标曲拟合； |
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2 |
样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到 |
尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测 |
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3 |
样本含量很高，超过标曲 |
建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内 |
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标曲高浓度间无明显趋势 |
1 |
如ODdui值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度 |
TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。 |
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2 |
仅作单波长检测。 |
由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议zui终结果以双波长为zui准确。 |
