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质粒提取实验步骤 古朵生物√

发布时间:2020-06-22 阅读:32

实验原理

现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法,前两种方法较为剧烈,适用于较小的质粒(<15Kb),而去污剂裂解法则比较温合,一般用于分子量较大的质粒(>15Kb)。


碱裂解法是一种zui广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为:染色体DNA远大于质粒DNA,且染色体DNA为线状分子,而质粒为共价闭合环状分子。当pH值为 12.0-12.6,碱性环境中,线性的大分子的染色体DNA完全变性且无法复性,而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可恢复其天然构象;在高盐浓度存在的条件下,染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA为可溶状态,通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA仍在上清中。残留的杂质可以通过酚lv仿处理掉。


实验过程

1、实验试剂

(1)溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0;

(2)溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS;

(3)溶液Ⅲ 3Ml 醋酸钾 / 2Ml 醋酸;

(4)异丙醇,无水乙醇,75%乙醇应放-20℃冰箱预冷备用;

酚lv仿放4℃冰箱预存;

(5)摇菌,2-3ml相应抗性的LB培养液,在37℃温度下过夜培养。


2、质粒提取

(1)菌液12000rcf离心5min,弃掉上清,加入0.2ml溶液I(已加入RNase),充分混匀后,加入0.25ml溶液II,颠倒混匀,室温放置5min,加入0.4ml 溶液III,颠倒混匀后,13000rcf 离心30min。

(2)上清转入新的1.5mlEP管中,加入等体积的酚lv仿混合液,充分混匀。10000rcf 离心10min。

(3)取上清,转入新的EP管,加入等体积、预冷的异丙醇,充分混匀后,13000rcf 离心 6min。

(4)倒掉上清液,用1ml预冷的75%乙醇,颠倒后,13000rcf 离心 1min。

(5)倒掉上清液,沿壁加入1ml预冷的75%乙醇,直接倒掉。

(6)沿壁加入1ml预冷的乙醇,直接倒掉。倒扣5min后,室温下放置10min。

待管内液体会发干净后,向管内加入100ul水,55℃孵育5min。

      (7)所得质粒溶液可以放入-20℃中长期保存。



注意事项

  1. 若菌株为革兰氏阳性菌,该菌有一层细胞壁,必须加入溶菌酶才能使之溶解。

  2. 摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5即可。

  3. 溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存,以防酶失活。

  4. 溶液II和溶液III使用前需注意观察是否有沉淀,如有沉淀可37℃水浴处理。

  5. 溶液II处理菌体时间应控制在5分钟以内。


常见问题及解决方法

常见问题

原因

解决办法

质粒浓度低

溶液处理不充分

增加溶液I/II/III的加入量,或降低菌液体积。


质粒拷贝数低

增加摇菌量,并降低zui后的溶解体积


菌体老化

重新质粒转化或划线后挑取单克隆摇菌


乙醇残留

乙醇的存在会影响质粒的溶解和回收,须延长乙醇挥发时间


洗脱液不合适

可配置合适的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA,pH8.5)


洗脱体积较小

在保证质粒浓度的前提下,增加洗脱液的体积

质粒有杂带

菌液污染

重新质粒转化或划线后挑取单克隆摇菌


试剂污染

质粒提取溶液重新配置,zui后溶解液高压灭菌后使用


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