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质粒提取过程中遇到的10大基本困惑!

发布时间:2020-09-10 阅读:53

是不是在质粒提取过程中总会碰到提取的质粒浓度不够或者纯度不够的情况?

其实经常提质粒之后,会发现提质粒是一项非常简单且基本的实验操作。但如果真问起一些质粒提取的一些细节,可能很多人回答不了。不信随我看看。

首先,质粒的提取可分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。目前大多数实验室都选用试剂盒方法来提取质粒,可以根据不同的实验需求,来选择相应的试剂盒。

质粒小提主要是对于1ml-5ml的大肠杆菌菌液中质粒DNA进行小量提取,获得的质粒用来进行常规的载体构建实验。

而质粒中提,是在质粒小提的基础上进一步去除菌液中的内毒素,获得的质粒可以用于细胞转染,常规需要菌液量为10-15ml。

质粒大提与中提方法相同,一次可对100ml-200ml菌液进行抽提,从而获得大量质粒。

10大问题,帮您解决在质粒提取过程中遇到的zui基本的困惑

1.质粒制备的基本原理是什么?

在分子生物学实验中,大多数人都做过质粒提取,但并不是所有的人都知道质粒制备的基本原则。

碱裂解法是提取质粒zui常用的方法。

质粒先是被转化到大肠杆菌中,然后挑选单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中,当培养的大肠杆菌达到生产的平台期时(一般为12到16个小时),通过高速离心开始收集大肠杆菌;使用试剂盒的悬浮液把菌体全部重悬并用SDS-NaOH进行裂解。

因为SDS是一种很强的去污剂,可以把细胞膜中的蛋白质和磷脂抽提出来,从而使细胞内的物质得到释放,而NaOH是强碱,可以让蛋白质、染色体DNA和质粒DNA进行变性;当菌体彻底裂解了以后,再加入酸性醋酸钾,用来中和碱性裂解液,同时变性蛋白质、变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀,但是在上清溶液中,存在正确复性的质粒DNA,通过离心,可以收集上清溶液。zui后通过试剂盒的核酸吸附材料,来对上清液中的质粒DNA进行回收。

2.质粒DNA制备的关键是什么?

使用碱裂解法制备质粒的关键是把握好SDS-NaOH处理菌体的时间。

如果质粒长时间处于碱性环境,就有可能出现不可逆的变性反应,使得zui终提取出来的质粒中含有变性质粒。这些变性质粒,由于不能进行酶切反应,所以无法进行实验。

3.质粒中基因组污染是怎么产生的?

当在质粒提取过程中变性和中和的步骤处理不当时,就会参数基因组污染。

如果在提取中进行溶液混合时,操作过于剧烈,就会导致基因组DNA被剪切成小片段,zui后在中和时同质粒DNA一起复性保存在上清溶液中,同时被回收出来。

4.如何确定质粒小抽细胞的用量?

对于一般的载体构建等常规实验,几微克的DNA就足够使用了。因此一般小提5ml菌液,都能够满足要求。

如果使用过量的细胞,由于试剂盒的限制,会很难把菌液裂解等,而且DNA的纯度和得率并不会显著提高。所以对于需要大量的质粒时,因考虑geng换提取试剂盒或者按比例提高各溶液的用量。

5.电泳分析抽提的质粒会看到什么?

如果是制备出来纯度非常差的质粒,那么从电泳加样孔往下,您看到的条带依次是基因组DNA,开环环装质粒(opencircularplasmid),超螺旋质粒(SuperCoiled),变性的超螺旋质粒(denaturedsupercoiledplasmid),细菌RNA。

高质量质粒胶图主要部分为超螺旋质粒,没有RNA等的污染。

6.质粒制备的得率是由哪些因素决定的?

属主细胞类型、大肠杆菌的数量、质粒的拷贝数和提取过程中使用纯化方式(试剂盒类型)。

7.您的质粒需要什么样的纯度?

同样对于一般的载体构建等常规实验和送去测序检测的话,用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。

如果是质粒需要用来做细胞转染实验的话,则需要无热源,无内毒素(LPS)。

8.为什么酶切鉴定“有插入片段”的

质粒测序却发现是空的?

产生这种现象的zui主要的原因是提取质粒的过程中产生了变性的超螺旋质粒,限制性内切酶无法对它进行酶切。所以在判断酶切效果时通过电泳进行分析,变性的超螺旋质粒常常被误认为是酶切下来的片段,导致误判。其实只需要在酶切后的电泳分析增加一个原始质粒进行对照就可以避免误判。

9.如何判定DNA的纯度和浓度?

使用试剂盒抽提的质粒DNA,可以通过仪器检测OD260和OD280浓度,通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之间。估算质粒浓度可以通过琼脂糖电泳来判断会geng准确一些。

10.为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解?

如何解决?

产生这个问题的原因有很多,主要还是因为核酸酶的污染。

除了在质粒提取过程中会带入核酸酶外,根据有关报道发现,质粒属主细胞的种类也会影响到抽提质粒的质量。如果提取的质粒需要长期保存,可以使用内含丰富的核酸酶活性的大肠杆菌,比如DH5α,DH1,HB101等

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