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常用菌种的保藏方法有哪些

发布时间:2020-11-19 阅读:65

 菌种,多是指国家指定的几个菌种保藏中心的成品菌种,在液氮状态下,盛放在安瓿管中。企业生产按国家要求,必须要国家指定的菌保中心购买菌种,不得采用外来菌种。

一、常用菌种保藏方法

1、菌种保藏原理

根据微生物的菌种生理、生化特性,在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度,使细胞基本处于休眠状态,生长繁殖受到抑制但又不至于死亡,以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。

低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时,首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性,同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中,往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。

2、菌种保藏步骤

①挑选特征典型的纯菌菌落;

②确定保藏的合适菌体形态;

③选择zui适宜的保藏方法;

④定期对保藏菌种进行检查,观察是否发生变化,若有变化,须改变保藏方法,保藏期满应及时进行移种;

3、琼脂斜面低温保存法

(1)方法:

将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面(某些特殊菌种可用液体培养基)上,按规定的温度和时间培养,待充分生长后,把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好,为减缓培养基的水分蒸发,延长保藏时间,可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次,继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养,一般可保藏半年——一年。有的甚至geng长时间。

(2)适用范围:细菌、酵母菌、霉菌保藏。

(3)特点:

优点是——简便,易于推广;一般不需要另选择保藏用培养基;对大多数微生物都适用;

缺点是——保藏期太短;传代次数多,易发生变异及污染。

(4)注意事项:

保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物,至少应是第三代的培养物。

保藏时,破伤风杆菌可用庖肉培养基;生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉,如有异常应及时处理。

每次移植后,应与原菌种的编号、名称逐一核对,确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。

保藏菌种的培养基应无糖,其他菌类含糖小于2 %为宜,以免产酸过多,影响菌种存活。

铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡,不宜用本法保存。

4、液体石蜡保存法

本法是用石蜡将培养物与空气隔绝,以降低菌种的生理生化水平,并可防止水分蒸发,从而延长菌种的保藏期:

(1)方法

将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5 %琼脂半固体高层培养基中,培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中,每管10~15mL,加棉塞,瓶口包上纸,121℃高压灭菌30min,取出置37℃温箱或110~ 170℃烤箱中1 ~ 2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内,液体石蜡液面以高出培养基zui上端1㎝为宜,将试管直立,放入4℃冰箱中保藏。

(2)适用范围:适用于保藏部分霉菌,酵母菌和放线菌,对细菌保藏效果较差。

(3)特点:本方法简便易行,是实验室常用的一种保藏方法,该法主要使菌种与空气隔绝。

(4)注意事项:

①保藏时,用新鲜培养物接种,应检查纯度和特征后,方可进行保藏;

②保藏过程中,需经常观察斜面是否干燥,如干燥,需重新移种;

③使用菌种时,先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边,再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养,待长出新培养物后,再移种一次到新斜面上即可使用;

④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻,再烧灼灭菌,以免直接在酒精灯下烧灼时,液体石蜡四溅,引起污染;

⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制,如太多,会影响菌种交换气体,使保藏效果不好;如太少,斜面容易干燥,将缩短保藏期。一般以高出斜面1cm为宜;

⑥制备无菌液体石蜡时,每管装量不能太多,否则分装到菌种培养基中易造成污染。

二、菌种的复苏与保存

菌种的复苏与保存应在专用超净工作台或生物安全柜内进行。

1、菌种的复苏

把冻干菌种管、灭菌1mL滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支,移入超净工作台或生物安全柜。

先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干,用75%乙醇棉擦净,放在灭菌双碟内,待干。点燃酒精灯,将菌种管的封口一端在火焰上,烧灼红热,用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基,滴在灼热的菌种管封口一端,使骤冷而炸裂。

取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂的管口打开,放入灭菌双碟内,另取1支灭菌滴管,在火焰旁吸取营养肉汤少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内,并将滴管及菌种管投入消毒液内,将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24h。

取出培养物,仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检,呈典型菌落后,转种3代即可应用。如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。

2、菌种的传代与保存

方法1:菌斜面(保存)

培养基应新鲜制备,如斜面已无冷凝水者,不宜再使用。标签上注明菌名及接种日期。

至冰箱取出的菌种斜面,应在室温放置约30分钟,待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

点燃酒精灯,用左手握住菌种斜面,将管口靠进火焰旁,右手拿接种棒后端,将接种环烧红30秒,随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼,往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼,右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞,拨开棉塞,将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下,稍冷却再移至菌苔上,刮去少量菌苔,随即取出接种棒,并将菌种管口移至火焰旁。

堵上棉塞,左手将菌种管放下,取营养琼脂斜面1支,照上述操作打开棉塞,将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部,由底向上,将接种环轻贴斜面的表面曲折移动,使细菌划在斜面的表面上。

取出接种棒,在火焰旁将培养基管棉塞堵上,然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。

将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时,霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存,一般 3个月转种一次。

方法2:菌斜面-营养肉汤-分离平板-菌斜面

如果菌落形态不典型可纯化,按下列方法传代(分离菌落):用接种环取上述菌管(斜面)菌苔少许接种置营养肉汤中(5mL/支,已灭菌),置35~37℃培养18~24小时后,再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液(浓菌液),接种于分离平板,置35~37℃培养18~24小时,用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面,置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管,其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中,其它用做工作菌种。

常用分离平板包括:大肠埃希菌——EMB琼脂平板;铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基;金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基。

3、菌悬液的制备

取上述培养好的菌种斜面移入超净工作台或生物安全柜,放置室温后,用接种环取菌苔少许接种置营养肉汤中(5mL/支,已灭菌), 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养18~24小时,取出备用。

一般于冰箱中保存可用7天。

4、对照用菌液制备

取上述培养好的营养肉汤菌悬液(浓菌液1mL,加到9mL,0.9%无菌氯化钠溶液混匀,为10-1,再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL,0.9%无菌氯化钠溶液混匀,为10-2……以此类推,稀释至含活菌数在50 ~ 100个。用平板计数。

此稀释菌液用于试验后加阳性对照,可在1天内使用。

5、菌种保管

菌种保管应有专人负责,保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处,确保菌种安全。因工作变动时,必须做好交接工作。菌种应有详细登记本,包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能,并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异,如,发现污染和变异时,应及时geng换。购置菌种,应有介绍信。全部保存菌种应具备清单,并定期向部门负责人报告

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