如何检测食品中霉菌是否超标？

食品中霉菌检测标准是GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，它可以定量测定食品中霉菌数量，用相应的产品标准判定食品中霉菌是否超标。
检测中的注意事项：
1、 取样的代表性
2、 取样工具的无菌
空气中霉菌的孢子含量很高，所以，取样的工具、容器等要经过严格的高压灭菌。

3、 检样的方法
(1)由于霉菌易被携带，所以，检样时操作人员应尽量避免自身携带的可能。
(2)样品的均质及充分振摇。因为有些孢子是连成串的，故均质和振摇能使其充分散开，同时，在各梯度连续稀释时，也要用灭菌吸管反复吹吸几次，使孢子充分散开。

4、培养温度和时间
培养温度 25-28℃培养，5 天后观察。
霉菌检验中常用的培养基：孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂等。

5、检样中常见的问题
(1) 不同稀释度计数结果不相同；
(2) 不生长或生长很好连成片无法计数；
原因：①稀释时未经反复振摇，吹吸，导致孢子未充分散开，影响了计数的结果。②由于培养基不适宜，PH 值低等，致使生长较慢。③观察时间的掌握。真菌生长较慢，故需 5d 后才能观察出结果。

微生物操作中常见问题的讨论与分析
1、 划线获得单个菌落的方法
划不出单个菌落的原因：
(1) 平板上有过多的水分；
(2) 划线时接种环未经反复灼烧；
(3) 多区划线，三区或四区划线。

2、 涂布和倾注的区别：
涂布利于观察，但由于涂布棒上会带有少量的菌液，可能影响计数的准确性；倾注为准确，但不利于观察菌落的状态。
Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现，对霉菌计数来说，涂抹法有以下几方面优越于倾注法：①培养出的霉菌菌落数较多；②培养所需的时间较短；③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就受影响，而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。

3、培养基的选择
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO)，其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长，而CAO则适合于高渗性霉菌生长，酵母菌几乎不长。

在日常检测中我们发现，有些常见的耐高渗性霉菌，如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长，而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方：蔗糖400g，麦芽提取汁20g，酵母提取汁5g，琼脂20g，氯霉素50mg，蒸馏水1000mL；DG18琼脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝ji苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，PH6.5)上则正常生长。孢子、形态特征发育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长，因此，若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌，将能全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等，有必要同时采用M40Y或DG18。

由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素，危害较小，而有的菌株即使污染数量不多，但其产生的霉菌毒素却危害较大，因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能好地判断被污染食品的安全程度。

为此，国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝ji苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。

4、 培养基配制时应注意的问题：
(1)灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量；
(2)琼脂培养基不能反复溶化。反复溶化会破坏培养基中的营养成分；
(3)培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏；
(4)含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。

5、 平板的保存：
大多数平板如 VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。

6、 产品的保存：
(1) 干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。
(2) 亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，避免水浴加热。
(3) 抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度的下降。
(4) 兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。

7、 观察时间的掌握：
按SN、GB 等标准或培养基的使用说明所述时间进行观察，时间过短或时间过长，单菌落的特征都不会很明显。如单增李斯特氏菌显色培养基，时间短单菌落看不到卵磷脂环，时间长绵羊李氏菌也会产生沉淀环。OXA、PALCAM的观察也如此，时间过长，李氏菌使整个平板成黑色，不利于观察单个菌落。

8、 添加剂的添加：
(1)温度的掌握。卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。
(2)定量。过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。

8、 培养温度的掌握：
(1)真菌类。25-28℃培养
(2)细菌类。李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在 30℃左右。
(3)其他一般在 36℃左右。

9、 接种方法：
常用的方法主要有划线、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。

10、革兰氏染色方法：
染色时间的掌握、冲洗的方法。

11、生化实验：
(1)接种的方法
(2)氧化型和发酵型实验操作
(3)阳性菌种的对照
(4)接种前的纯化。挑取单个菌落进行一系列的生化。

12、适计数范围
霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。
我们对这方面作了一些观察研究，首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/mL的孢子悬液，并用血球计数器在显微镜下准确计数，然后将孢子悬液作10-1~10-6倍稀释，吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA，25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示，大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果蕞接近；有近一半的菌株，每个平板含50~100个菌落已较难计数，而大部分菌株，超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别，因此，应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。
而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围，可在培养基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，庆大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。

13、关于杀菌的几个概念：
(1)抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。
(2)死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。
(3)防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物fu败或防止食物霉变。
(4)消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有bing原微生物的一种措施，它可以起到防止感染和传播的作用。
(5)灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有bing原微生物的一种措施。