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免疫球蛋白IgG的提取

发布时间:2022-03-27 阅读:47

一、目的及要求
了解和掌握免疫球蛋白的提取方法。

二、概 念
抗体是在抗原物质刺激下,人或脊椎动物免疫系统的浆细胞产生的,能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白,主要存在于人和动物的血清及其体液中。

三、免疫血清的制备
(一)动物的选择
实验室常用的动物是家兔和羊,有时也用豚鼠或鸡,大量制备商品性抗血清时,可采用马、牛等大动物。对动物的基本要求是:
1、与抗原物质的种属关系越远越好;
2、发育成熟、健壮、体重合乎规定,如家兔要求体重在2~3Kg以上;
3、好为成年雄性动物,如用雌性动物,则不得用怀孕者。

(二)抗原的种类、质量要求及用量
1、抗原的种类
抗原是决定所制备免疫血清特异性的关键,在免疫前必须进行鉴定。
制备免疫血清的抗原可以分为以下三类:
1)微生物抗原:如细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、真菌等;
2)组织抗原:主要是各种蛋白质或蛋白质复合物,如各种酶类、激素、结缔组织成分、血浆蛋白、肿瘤组织等;
3)免疫球蛋白抗原:这种抗原在免疫荧光和免疫酶技术中应用广;
2、抗原的纯度
抗原纯度要高,应用病原微生物时,应选择抗原性强、稳定和标准的菌株或毒株。细菌性抗原应避免有培养基成分,培养病毒的组织尽量采用与被免疫动物同种的组织,培养用的生长液也应避免含有抗原性强的物质,用Hank ′s氏液等为好。
3、抗原的用量
抗原量过小,不能有效地刺激机体产生抗体;抗原量过大,也影响抗体的产生,所以抗原量要适当。抗原用量视抗原种类、剂型和注射途径而异。采用弗氏佐剂,剂量较小,一次注射剂量以1mg/kg体重为宜,不加佐剂的剂量要大10倍以上。静脉注射剂量要小些,以免引起动物死亡。

(三)免疫的途径与方法
免疫途径应是多种多样的,如静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下和淋巴结等,但肌肉和皮内两种途径较少应用。目前一般倾向于小剂量、多点、多途径的方法,但具体应视抗原的生物学特性和理化特性来决定。酶、毒素等生物活性抗原,一般不宜采用静脉注射。球蛋白抗原免疫可选用皮下、皮内和肌肉注射。但效价不高,因此大都选用抗原加弗氏佐剂、足掌皮下注射的方法,或者注卡介苗使腘淋巴结肿胀,然后直接注入腘淋巴结内的方法,增强抗体的产生。
足掌注射为近年来常用的免疫途径,能获得相当良好的效果,但剂量不宜过大,一般家兔0.2~0.5mL,否则肿胀严重。有的采用先经足掌内注射卡介苗(后足掌各注 0.2~0.5mL)。10~14d后,腘淋巴结肿大,然后向淋巴结内注射加有完全佐剂的抗原,两侧各0.5mL左右,半个月后再注射不加佐剂的抗原(3mg/mL)皮下或肌肉多点注射,每点0.1mL,总量0.5mL左右、这样免疫效果较为理想。
注射次数可分为一次注射和多次注射两种。一次注射,抗体产生的慢,效价低,但特异性高,如果再次注射,抗体产生的快,效价高,持续时间也较久。多次注射,可得高效价血清,但往往特异性较差.多次免疫的间隔时间,可因抗原性质不同而异。

(四)佐剂
佐剂是一种和抗原一起免疫动物,能增强抗原的免疫原性,加强抗体形成的物质,如明矾、磷酸铝、氢氧化铝、结核分枝杆菌、短小棒状杆菌和细菌内毒素等。
细菌、细胞等颗粒性抗原的免疫原性较好,通常均用其悬液直接免疫,不加佐剂。可溶性抗原,尤其纯化制剂,一般免疫原性较低,应该加入一定的佐剂,以提高其免疫效能。
目前常用弗氏佐剂(Freundt′sadiuvant),其主要成分为羊毛脂、石蜡油和卡介苗所组成。有卡介苗为弗氏完全佐剂,不加卡介苗为弗氏不完全佐剂。弗氏佐剂配方有多种,羊毛脂与石蜡油之比,一般为1︰2(羊毛脂10g加液体石蜡油20mL),也有用1︰3、1︰4甚至1︰9 的,应根据药品质量而定。先将羊毛脂与石蜡油按比例混合好,羊毛脂1份、液体石蜡油2~4份,混匀,高压灭菌,冰箱保存,临用前与等量抗原溶液混和研磨,乳化,即为弗氏不完全佐剂抗原。如在其中加入2~4mg/mL卡介苗(100℃、10min杀菌),则称为弗氏完全佐剂抗原。充分乳化是获得良好免疫效果的关键,如果放置后油水分层,表明乳化不良,滴于水上不扩散为乳化良好.有时可加入1%Tween-80,以加强乳化效果。

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