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ELISA常用检测法——竞争法原理介绍

发布时间:2022-05-07 阅读:31

做ELISA实验,有几种常见的实验方法,他们分别是竞争法、捕获法、间接法、夹心法、而夹心法又可以分为双抗体夹心法和双抗原夹心法!在今天的文章中,古朵生物将详细得跟大家讲述竞争法的实验原理!
竞争法一般分为直接竞争法和间接竞争法,这里我们以直接竞争法为例进行原理讲解。直接竞争法,其基本原理是:将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中,加入无关蛋白载体封闭未结合位点,加入标准品(样本)和生物素标记的抗原物质进行竞争结合,经合适的温度和一定时间的孵育,洗涤后,加入HRP标记的链霉亲和素进行反应,TMB显色,微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。

该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质,当然,这种方法也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时,由于空间位阻的影响,使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。这种方法在检测抗体时,可能由于两种竞争的抗体来源不一,导致两种抗体趋同性不高,就使得检测结果的可靠性不高。

当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

实验步骤

以稀释液将待检标本做适当稀释(预试中确定)加入包被有已知抗原的酶标板中(50ul/孔),加封口胶带于37℃作用30min。

2.  弃反应液,以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。

3.  加入酶标抗体(浓度在预试中确定)。加封口胶带后于37℃作用30min。

4.  重复第2步。

5.  加底物(浓度在预试中确定),加封口胶带后于室温下避光作用5-60 min,其间不时观察,显色满意后加终止液50ul/孔。

6.  于酶标仪测定OD值,OPD用492nm测定,TMB用450nm测定。

注意事项

每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照(以PBS代替标本),后者为本底值,在分析实验结果时应扣除本底值,阳性对照<阴性对照<空白对照实验成立。

2.  一般认为小分子抗原宜用本法检测,而大分子抗原则宜采用夹心法检测,但具体宜采用哪种方法应根据试验决定,本发与夹心法相比在操作上减少一步。包被抗体与酶标抗体如果分别采用单克隆抗体和多克隆抗体时,宜用单克隆抗体作为包被抗体,以多克隆抗体作为酶标抗体。

3.  血清标本中抗原浓度一般较低,故一般用原倍标本进行检测,必要时可进行稀释测定,但应重新摸索酶标抗原的浓度,以确保方法的灵敏性。

4.  以酶标记抗原的方法同酶标记抗体。

5.  其它注意事项同酶联免疫间接法。

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