古朵带您了解凝胶迁移实验常见问题?

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  古朵带您了解凝胶迁移实验常见问题?

  凝胶迁移实验常见问题

  1、为什么看不到迁移带?

  1)蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。

  2)样本中没有可以与探针结合的蛋白。

  3)探针与蛋白无特异性的相互作用。

  4)转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。

  5)曝光或者成像时间过短。

  在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：

  6)抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。

  7)测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少

  8)使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。

  9)多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

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