酶标记抗体-HRP标记抗体方法及标记步骤?

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  酶标记抗体-HRP标记抗体方法及标记步骤?

  HRP标记抗体的方法

  酶与抗体交联的方法有许多种， 根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法为常用。

  戊二醛二步法

  1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

  2. 标记步骤：

  (1)称取 HRP25 mg 溶于 1.25% 戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

  (2)反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1 ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5 ml,则以 PEG 浓缩至 5 ml。放置25 ml 小烧杯中，缓慢搅拌。

  (3)将待标记的抗体 12.5 mg 用生理盐水稀释至 5 ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

  (4)用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25 ml，继续搅拌 3 小时。

  (5)加 0.2M 赖氨酸 0.25 ml，混匀后，置室温 2 小时。

  (6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃ 1 小时。

  (7)3000 rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，后沉淀物溶于少量 0.15 M PH7.4 的 PBS 中。

  (8)将上述溶液装入透析袋中，对 0.15 M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 rpm离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

  3. 结果判定：

  (1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定 其活性。后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。

  (2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程 1 cm)。

  酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4

  IgG 量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg/ml)IgG 量(mg/ml)酶量

  克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 440,000 160,000 IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2~4% 的酶与蛋白质结合。

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