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古朵资讯| 细胞裂解提取蛋白的步骤

发布时间:2022-09-21 阅读:46

  标签:细胞裂解液 古朵生物 溶液


  古朵资讯| 细胞裂解提取蛋白的步骤


  在实验过程中,我们常常需要证明实验组相对于对照组某些蛋白质是多了还是少了,那么我们就需要先把细胞或组织中的蛋白质提取出来进行测量,今天古朵生物小编就给大家介绍一下细胞与组织蛋白质提取的基本知识和步骤。

  蛋白样品制备的原则:

  1.尽可能采用简单方法,以避免蛋白丢失;

  2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解,低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解;

  3.样品裂解液应新鲜制备,并分装存于-80℃,勿反复冻融已制备好的样品;

  4.通过超速离心清除其余杂质。

  一般的理解方法分为温和的裂解方法和剧烈的蛋白裂解方法。

  温和的裂解方法

  用于组成比较简单的样品,或分析某一特定的细胞器。

  (1)渗透裂解:血细胞、组织培养细胞

  (2)冻融裂解:细菌、组织培养细胞;液氮冻融

  (3)去污剂裂解:用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞,释放内容物;用于组织细胞

  (4)酶裂解细胞:植物、细菌和真菌等含有细胞壁的细胞

  剧烈的蛋白裂解方法

  常用于难于破碎的细胞,如固体组织内的细胞,或具有坚硬细胞壁的细胞,如酵母细胞。

  (1)超声波裂解法:细胞样品

  (2)弗氏压碎器:高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力,从而裂解细胞;常用于含有细胞壁的微生物、藻类

  (3)研磨法:常用于固体组织、微生物;冻存于液氮中,随后研磨成粉末

  (4)机械匀浆法:

  (5)玻璃珠匀浆法:利用剧烈振荡的玻璃珠打破细胞壁;用于细胞悬液或微生物

  那么蛋白提取的步骤来了:

  所需器材:低温高速离心机,匀浆搅拌器,超声仪,真空泵,细胞挂勺等。

  所需试剂:RIPA裂解液,蛋白酶抑制剂(PMSF),无菌PBS等。

  蛋白样品提取

  1、细胞蛋白的提取:

  1.根据实验需要取出需要提取的细胞培养板,置于冰上,用吸引器吸除上清液。PS:所有操作均应在在冰上进行。

  2.每孔细胞(六孔板)中加入 1-2ml 4℃预冷的PBS溶液。平放轻轻摇动十秒钟清洗细胞,然后吸除洗液,共清洗洗细胞三次(目的是去除剩余的上清液),后一次不吸除上清液。

  3. 用刮勺将细胞轻轻刮下,接着用移液器将细胞和上清液转移至1.5ml离心管中,置入4度离心机(提前开离心机预冷),离心1.5min,弃去上清液。

  4.配置裂解液(所用裂解液为RIPA裂解液,可以使蛋白得到充分释放),每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。PS:PMSF属于蛋白酶抑制剂,可以减少蛋白质的讲解,另外的蛋白酶抑制剂还可以用cocktail,NaF,NaN3等,也可以同时加入多种蛋白酶抑制剂。

  5.将配置好的裂解液加入第3步获得的细胞沉淀中,一般5*10^6个细胞加入100ul的裂解液,然后吹打重悬,使细胞充分裂解。

  6.用超声仪进一步裂解细胞:将细胞放置于冰上进行超声,一般功率选择为15%左右,裂解时间为1分钟(超声2s,休息4s),当超声一次后,离心管仍比较浑浊,可以间隔几分钟再次超声。

  7.超声结束后,将细胞于4度离心机,12000rpm离心 25min。

  8.将离心后的上清分装转移至1.5ml 离心管,保存于-80℃备用。

  2、组织中总蛋白的提取:

  1.将少量组织块置于 1.5ml离心管中,加入500ul含PMSF的强RIPA裂解液,先用干净的剪刀将组织块尽量剪碎,当组织较软时(如脑组织),接着用1ml枪头不断地吹打吸取,然后用匀浆器进一步打碎组织,后用超声仪进行超声裂解;当组织较韧时(如肌肉组织),可以直接用匀浆器打碎组织,后用超声仪进行超声裂解。(裂解组织就是通过不同的方法让组织块不断变小)。

  2.同上方法,将离心管置入 4度离心机,12000rpm离心25min,取上清分装于1.5ml离心管中并置于-80℃保存。

  古朵资讯| 细胞裂解提取蛋白的步骤 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品,励志研发和销售的综合性生物公司,产品远销多个国家和地区,我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求”的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向,不断开发高质量的新产品,提供客户满意的综合服务质量”的方针。

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