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古朵解析 细胞培养用液的配制具体步骤与消毒方法

发布时间:2022-11-25 阅读:113


  细胞培养用液的配制具体步骤与消毒方法

  1.血清的灭活

  细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃ 水浴中灭火30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。

  2.HEPES溶液

  HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol /LHEPES即可达到缓冲能力。

  1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:

  准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。

  注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。

  3.谷氨酰胺

  合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。

  一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

  4.肝素溶液的配制:

  含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为¬¬ ℃ 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(可加入0.9ml)即可。

  5. Ⅰ型胶原酶:

  0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

  6..明胶溶液:

  因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。

  注意事项:

  1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。

  2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。

  3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值终为7.2,可在配制时调PH至7.4。

  经验总结

  1.明胶难溶,就称好,加pbs,高压灭菌,就ok了;

  2.血清,不用灭活,我养海马神经元和乳鼠根本不灭活,好的很,但有些细胞如平滑肌需要;

  3.双抗,由于其特殊性,水解,从来不加,只要操作ok,不需要;

  4.培养基重要,尤其对于自己配制的,有时候就是不好,ph和渗透压问题,一定要解决好。

  细胞培养用液上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品,励志研发和销售的综合性生物公司,产品远销多个国家和地区,我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求”的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向,不断开发高质量的新产品,提供客户满意的综合服务质量”的方针。

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