Western 免疫印迹具体操作说明书

  Western 免疫印迹具体操作说明书

  实验试剂

  1. SDS-PAGE试剂:见电泳实验。

  2. 匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

  3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

  4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

  5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。

  6. 显色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H2O2 1.0μl。

  实验步骤

  1. 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

  2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

  3. 转移：(半干式转移)

  (1) 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

  (2) 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

  (3) 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

  4. 免疫反应：

  (1) 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

  (2) 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

  (3) 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

  (4) 加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

  (5) 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。

  (6) 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。

  (7) 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

  (8) 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

  注意事项

  1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定*条件。

  2. 显色液必须新鲜配置使用，zui后加入H2O2。

  3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

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