Elisa实验| ELISA实验操作步骤及注意事项
Elisa实验| ELISA实验操作步骤及注意事项
一、ELISA实验步骤
1、固相载体选择
聚苯乙烯:具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯:聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。
2、包被
①板孔的选择:ELISA级别的微孔板;
②抗体选择:选择优质的ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索适浓度;
③包被缓冲液:pH7.2磷酸盐缓;
④包被温度:2-8C过夜包被或室温 (37C)包被2h;
⑤包被浓度:包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为lug/m-2ug。
3、封闭
D包被之后一定要立即封闭(封闭非特异性抗体)@选择效果较好的封闭剂 (细胞培养级BSA、Tween等)
4、加样及孵育
①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部;
②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500+50rpm;
③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示;@洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性;
封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。
做ELISA实验需要注意哪些问题?
1、ELISA操作前准备工作
试剂盒的选择ELISA操作前，应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。
样本处理在收集标本前需有一个完整的计划，需要清楚要检测的成分是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4°C备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请取材后，将标本及时分装后放在-20C或-80C条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。
2、ELISA标准品稀释
标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备，如离心管的准备和编号以及稀释液的准备;稀释时，应充分混匀;采用进口或者硅化的EP管，减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。
注意:@品牌试剂盒标准品是已倍比稀释好的，是即用型标准品。
3、ELISA操作中的洗涤
洗涤是ELISA实验中是多次数的操作，也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象，实验重复效果差的现象。
不管用多道加样器、洗瓶、吸管，还是洗板机，严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象，请比照“手工洗板小贴士”操
a)洗液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定会增高。
b)特别注意:设计实验的时候要考虑实验孔的位置保证甩掉洗液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体!甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
c)用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大。
d)每次拍板不要重复在一个地方拍，特别是洗去酶的步骤;拍板不宜过轻，否则拍不干净，拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重，以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下，后一次一定要扣干净。
e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短，洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景干净。
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