HYDS0034-100T 四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色）
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产品名称：HYDS0034-100T 四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色）
产品型号：HYDS0034-100T
产品厂商：上海古朵生物科技有限公司
简单介绍
产品名称：四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色），免疫荧光(immunofluorescence，IF)，通常是指用荧光标记的抗体示踪或检查样品中相应抗原的方法。根据抗原抗体反应，将不影响抗原抗体相互作用的荧光分子标记在抗体上，与其相应的抗原反应后，在荧光显微镜下针对荧光标记分子的激发光发射光进行观察，从而检测目的指标的相
HYDS0034-100T 四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色）的详细介绍
免疫荧光(immunofluorescence，IF)，通常是指用荧光标记的抗体示踪或检查样品中相应抗原的方法。根据抗原抗体反应，将不影响抗原抗体相互作用的荧光分子标记在抗体上，与其相应的抗原反应后，在荧光显微镜下针对荧光标记分子的激发光发射光进行观察，从而检测目的指标的相对含量、在组织细胞中的定位。
产品名称：四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色）
原理介绍:酪酰胺信号放大(TSA，Tyramidesignalamplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA 技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：480，520，570，620，690，780，488，CY3.此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。
原理介绍:酪酰胺信号放大(TSA，Tyramidesignalamplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA 技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：480，520，570，620，690，780，488，CY3.此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。
产品名称：四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色）
试剂盒组成：488荧光染料(绿光)(即用型，5mL),-20℃；CY3荧光染料（红光）(即用型，5mL)，-20℃；TSA+增强剂，100ul，-20℃（可选）；
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗（5mL）4℃。
备注：488荧光染料、CY3荧光染料在-20度下，均为固体，使用之前需解冻。
TSA+增强剂使用方法：TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号5-10倍，TSA+增强剂：荧光放大液=1:500，使用TSA+增强剂不是必须的选项，可以根据具体的情况选择添加
或者不选择添加。
操作流程：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ。取出放在通风厨内，酒精晾干后放入自来水中稍洗，蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满PH9.0EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。
3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA-PBS（或者其他封闭液）均匀覆盖组织，室温封闭30min。
5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6、加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次。
7、荧光染料反应：488荧光染料（或者CY3荧光染料）反应10-15min，PBS洗三次。
8、重复2-7步骤（换用另外一种荧光染料）
9、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
10、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
11、镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
| 染料 | 激发波长 | 发射波长 |
| DAPI蓝色 | 350 | 420 |
| 480 | 450 | 480 |
| 488绿色 | 480-490 | 512-520 |
| CY3红色 | 530-550 | 570-590 |
| 520绿色 | 490 | 520 |
| 570红色 | 550 | 570 |
| 620 | 590 | 620 |
| 690 | 630 | 690 |
| 780 | 750 | 780 |
产品名称：四色多重免疫荧光试剂盒（三标四色）
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